科研丨内蒙古农大: 牛奶发酵过程中的代谢差异和单个乳酸乳球菌乳亚种菌株间的发酵速率差异(国人佳作)

  综上所述，由于各个乳酸乳球菌乳亚种的发酵能力不同，观察到明显的代谢组学差异。

  导读细菌发酵剂在乳制品的发酵过程中起着至关重要的作用，然而，关于不同发酵速率的乳酸乳球菌乳亚种之间代谢差异的认识十分有限。本研究通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用法分析了17个乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp. lactis)菌株的发酵能力和代谢概况。代谢组学结果为，快速组(发酵时间16h)和慢速组(发酵时间≥16h)之间的代谢物存在非常明显差异。在快速组中，分别有98种代谢物增加、55种代谢物减少。快速组富含肽类和脂类，并且肽类、酯类和三丁酸甘油酯可当作生物标志物来区分组别。本研究根据结果得出，三丁酸甘油酯在调节菌种生长方面发挥着作用。这项研究从代谢方面对乳酸乳球菌乳亚种菌株之间不同产酸率的原因提供了一个新的见解。

  译名：代谢组学分析揭示牛奶发酵过程中的代谢差异和单个乳酸乳球菌乳亚种菌株间的发酵速率差异

  将全脂奶粉(11.5%)悬浮在蒸馏水(82%)中，溶解后加入蔗糖，经过均质、巴氏灭菌、冷却之后将牛奶分装到无菌烧杯中。将测试的17株乳酸乳球菌乳亚种(活细胞数为5×106CFU/mL)接种到牛奶中，在37℃下培养至pH值达到4.60，然后停止发酵(每个样品有三个重复)。在接种后和发酵后使用M17琼脂平板浇注法立即测定发酵乳中的活菌数，以确保活细胞数达到5×106 CFU/mL。发酵的牛奶被分装并储存在-80℃环境中。使用时将样品解冻、离心之后取上清液加入乙腈，静置离心之后旋转蒸发浓缩9 h，再加乙腈溶液，用0.22-μm的微孔膜进行过滤，将滤液收集在样品瓶中。同时，每6个样品采集一次质控样品。预处理后的酸奶样品通过UPLC-Q-TOF MSE做多元化的分析，并采用反向UPLC系统在液相中进行梯度洗脱。使用MassLynx4.1工作站采集UPLC-Q-TOF MSE获得的原始数据，并使用Progenesis QI做处理，获得所有代谢物的定量数据。通过监督偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，筛选出差异代谢物。根据差异代谢物的质荷比、保留时间和片段信息，检索Chemspider、人类代谢组数据库(HMDB)、METLIN、KEGG数据库，获得参考代谢物并完成鉴定。

  发酵乳是一种由发酵剂生产的营养丰富、对健康有益的功能性乳制品。发酵乳富含蛋白质、钙、钾、各种维生素和对身体有益的代谢物，如生物活性肽和胞外多糖，其中一些能改善炎症并调节宿主代谢。然而，发酵乳发酵后的酸化会使产品质量恶化，使得发酵乳的储存期缩短。传统发酵剂通常是Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricu和Streptococcus thermophilus，它们在乳制品发酵过程中产生各种代谢产物，如乳酸、肽、游离氨基酸和脂肪酸等。乳酸乳球菌乳亚种也是商业上使用的发酵剂，具有发酵乳糖的能力和蛋白质分解活性，并产生胞外多糖。它对发酵乳制品最终的香气、质地和酸度有着举足轻重的贡献，并且乳酸乳球菌乳亚种具有更加好的益生效果。为了改善发酵乳的风味、质量和安全性，必须探索发酵乳的代谢情况。尽管许多研究已经调查了发酵乳的代谢特征，但有关单个乳酸乳球菌乳亚种的发酵速率和代谢特征之间关系的知识是有限的。因此，本实验研究了在不同发酵速率下发酵牛奶的代谢特征，以揭示其与菌株代谢和生理学的关系。 超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱高能分析法(UPLC-Q-TOF MSE)是代谢分析中常用的分析平台。该平台具有高质量、高精度、高分辨的特点，可以准确地对代谢物进行定量和定性分析，因此成为非靶向代谢物测定的首选。为了深入探讨不同乳酸乳球菌乳亚种生产的发酵乳的发酵特性，本研究对17种不同的发酵乳进行了代谢组学研究。利用UPLC-Q-TOF MSE对发酵乳中的代谢物进行检验确定，发现各个乳酸乳球菌乳亚种菌株的代谢特征(即发酵速率)随其固有的代谢能力而变化。这项研究为一种常用发酵剂产酸率的控制因素提供了新的认识，并为筛选潜在的工业菌株提供了方法。

  为了确定发酵乳中的活菌数，在接种和发酵后分别记录发酵乳的菌落总数，并监测每个发酵乳整个发酵过程的时间(表1)。结果显示，发酵乳中乳酸乳球菌乳亚种的初始浓度为106 CFU/mL，当发酵达到终点时(pH=4.6)，浓度达到109 CFU/mL。以往研究表明，这17个乳酸乳球菌乳亚种可以产酸，所以在发酵过程中，随着菌株的生长pH值逐渐下降，这在某种程度上预示着每个菌株的发酵要求与其产酸能力有关。然后根据发酵时间将发酵乳分为两组：快速组(发酵时间16h)和慢速组(发酵时间≥16h)，随后的分析都是基于这种分组进行的。

  表1 单一菌种的发酵特性信息(即发酵过程中细菌密度的变化和牛奶发酵所需的时间)。

  用UPLC-Q-TOF MSE平台来比较不同的乳酸乳球菌乳亚种发酵乳的代谢谱。为了比较发酵乳的代谢水平差异，采用PLS-DA对发酵乳中的代谢物做监督分析(图2A)，并用R2Y(适配性)和Q2(预测性参数)来验证PLS-DA模型的准确性和预测性(图2B)。R2Y和Q2都大于0.7，表明PLS-DA模型拥有非常良好的准确性和可预测性。此外，每个平行样本都有聚类，在快速组和慢速组之间观察到明显的分离趋势。PLS-DA分析中的质控样品也被聚在一起，反映了仪器良好的稳定性和可重复性。因此，在发酵结束时，快速组和慢速组发酵乳样品的代谢特征有着非常明显的差异。计算两组代谢物的P值和差异倍数值，并以P＜0.05、差异倍数＞2和P＜0.05、差异倍数＜0.5为阈值绘制火山图(图2C)，以此确定两组的差异代谢物。离原点越远，这个变量的贡献越大，而差异越大越有很大的可能是一个潜在的标志物。最终，初步确定了153个差异代谢物。在快速组中，分别确定了98个增加(红点)和55个减少(绿点)的代谢物(表S2)。

  (A)用偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)分析发酵结束时快速和慢速发酵组之间的代谢物数据。(B)PLS-DA模型的验证指标，R2Y和Q2。(C)火山图说明了发酵后快速和慢速发酵组的代谢物。(原文图1)

  功能通路分析可以将代谢物的变化与特定的代谢途径联系起来。圆圈的颜色代表富集的程度，显著性从红色(最显著)到黄色(最不显著)进行收缩。横轴代表影响值富集因子，纵轴代表P值的大小。在本研究中，功能通路分析显示，153个代谢物主要富集在7个代谢途径中(图3)，即脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，肌醇磷酸酯代谢、二甲苯降解，以及氨酰-tRNA生物合成途径。虽然在苯丙氨酸代谢途径中只涉及一种差异代谢物，但两组之间有显著差异(P=0.03)。

  圆圈的大小表示有多少代谢物被富集，圆圈越大，富集的代谢物就越多。圆圈的颜色代表富集的显著性，红色越深，该途径的富集越显著，横轴代表富集因子，纵轴代表P值的大小。(关于本图例中对颜色的解释，请参考本文的网络版)。(原文图2)

  为了鉴定差异代谢物，利用MSE数据采集方法获得母离子和相应的片段信息。根据保留时间和质荷比，通过Progenesis QI软件筛选，共鉴定出37种代谢物，包括6种酯类、26种肽类、1种酰胺类和4种其他代谢物。分析各发酵乳中差异代谢物的含量发现，快速组脂类和肽类的含量高于慢速组(图4A)。为了全面研究单株乳酸乳球菌乳亚种发酵乳代谢物的变化，以及不同样品之间的关系和代谢物数量的差异，对代谢谱进行了比较分析，并构建热图来比较和识别不同发酵乳中差异代谢物的分布(图4B)。在快速组和慢速组之间确定的差异代谢物的丰度是明显不同的。肽类和酯类是快速组和慢速组之间的主要差异代谢物。快速发酵组的牛奶含有许多肽，如ser-trp、phe-ile、asp-arg-his、leu-phe-leu和ile-ile-phe-tyr，以及各种酯，如棕榈酸乙酯、乳酸乙酯和三丁酸甘油酯。这些酯类使发酵乳具有独特的风味，并提高最终产品的质量。快速组的四肽含量高于慢速组(图4C)。分析不同代谢途径的代谢物的丰度发现，快速组含有较高的苯丙氨酸和色氨酸。在快速组出现的肽中，重要的氨基酸是脯氨酸、精氨酸和苯丙氨酸(图4D)，苯丙氨酸也是快速组和慢速组差异代谢物富集途径中的主要物质。

  (A)不同的乳酸乳球菌乳亚种单一菌株发酵乳中鉴别出的差异代谢物的分布。(B)氨基酸出现的频率。(C)瀑布图显示肽类代谢物的比例。(原文图3)

  发酵乳发酵速率的不同是由许多因素造成的，如菌株的产酸能力和接种剂量。因此，在本研究中通过控制接种剂量研究了发酵乳中的差异代谢物。在差异代谢物之间观察到强烈的相关性(R0.68，R-0.68；P0.05)，表明发酵乳的代谢物可以相互影响。大多数强相关关系是在多肽之间观察到的，一些多肽也与三丁酸甘油酯表现出强相关关系(图5)。三丁酸甘油酯、thr-arg-gly-his、asp-thr-thr-lys和leu-val-leu与发酵时间明显负相关(P0.001，R=-0.8192；P0.001，R=-0.7097；P0.001，R=-0.6900；P0.001，R=-0.6827；表S3)。而大多数肽类和酯类在快速组中富集，这进一步表明，酯类和肽类可能调节发酵时间。因此，不同代谢物的变化改变了不同发酵剂的发酵环境，直接或间接地影响发酵时间。

  圆圈的大小表示丰度的大小，圆圈越大，丰度越大。红色代表发酵时间，黄色代表三丁酸甘油酯，橙色代表二肽，紫色代表三肽，绿色代表四肽。发酵时间和差异代谢物之间的重要关联由弧形线连接，线的颜色表示相关的强度，与颜色方案保持一致。颜色代表1和-1之间的Spearman相关系数数值大于0表示正相关，反之亦然。(原文图4)。

  ROC曲线是评估一个或多个生物标志物预测性能的图形工具，表示一个生物标志物区分两组的能力。使用随机森林算法来计算影响率，绘制该物质和曲线下面积(AUC)的折线A)。AUC值越接近于1，预测结果越好。在本研究中，83个代谢物的AUC有很高的影响率，超过1.00，排在84名的代谢物的影响因子为0.968(图6B，表S4)。根据差异倍数和P值，将机器筛选的前83个代谢物与联合筛选的代谢物进行比较。在两组结果之间的重叠部分出现了14种差异代谢物(图6C，表S5)，标红的是那些根据P值和差异倍数值筛选的差异代谢物与用机器筛选的代谢物的重叠部分。所鉴定的差异代谢物具有良好的代表性，这可能为在快速组和慢速组之间快速分类菌株提供了一种新的方法。这14种代谢物包括11种肽类和3种酯类，进一步表明肽类和酯类的含量与发酵速率有关。

  图6 代谢物的接受者操作特性(ROC)分布在快速组和慢速组之间存在非常明显差异。

  (A)代谢物数量和相应的ROC图。(B)ROC曲线。(C)机器模型筛选出的差异代谢物，红色字体表示与P值和差异倍数值筛选出的差异代谢物重叠的代谢物。(原文图5)。

  乳酸乳球菌乳亚种是一种工业发酵剂，被美国FDA认为是“GRAS”(一般是安全的)。这种发酵剂发酵性能好，并为发酵产品提供风味。不同的乳酸乳球菌乳亚种菌株具有独特的特征。以往的一项研究分析了227个乳酸乳球菌乳亚种菌株的表型和功能基因，发现各菌株之间的发酵特性(如发酵时间、粘度和游离氨基酸氮)存在很明显差异，这种差异引起了碳水化合物利用和乳酸生产基因的强烈品系特异性选择。为了进一步探讨不同的乳酸乳球菌乳亚种在发酵乳中的代谢差异，从227个菌株中选出17个菌株，用于牛奶发酵，并进一步研究它们所需的发酵时间和代谢情况。

  在这项研究中，采用UPLC-Q-TOF MSE研究乳酸乳球菌乳亚种在不同发酵速率下发酵乳的代谢特征。快速组富含各种酯类和肽类，尤其是三丁酸甘油酯，它可能是一个潜在的发酵速率的生物标志物。酯类有助于为发酵牛奶提供风味，酸奶的醇类可以与游离氨基酸结合形成酯类。在本研究中，酯类如丁酸戊酯和棕榈酸乙酯在快速组中被富集。因此，快速组发酵的牛奶的味道可能比慢速组的要好。 在发酵过程中，LAB将牛奶蛋白水解为肽、氨基酸和其他代谢产物，不同菌株的发酵特性在某些特定的程度上不一样，导致了发酵乳中肽谱的差异。共鉴定出26种差异丰富肽，大多数肽的含量在快速组中高于慢速组，只有两种差异性肽在慢速组中富集。快速产酸菌株能有效地产生乳酸，使牛奶酸化，来提升蛋白酶等酶的活性，并迅速将蛋白质降解为短肽。

  尽管本研究没有评估这些肽在发酵乳中的功能，但发酵乳中的肽已被证明表现出许多有益作用。因此，益生菌驱动肽的产生可以被认为是促进发酵乳营养价值的关键过程。LAB不能同化氮源，它们在牛奶中的生长依赖于其蛋白质分解系统降解蛋白质和肽的能力，以满足氨基酸的需求。通过研究乳酸菌对肽和氨基酸的消耗，发现乳酸菌的生长依赖于低聚肽，LAB生长的98%的氮源由低聚肽组成，但二肽和三肽运输系统在使用各种氮源中的作用仍不清楚。研究之后发现L. gasseri在牛奶中的生长需要肽来提供氮源，而不是蛋白质或游离氨基酸，因此，比较小的肽可能是L. gasseri乳糖培养基中更合适的氮源。乳清肽提取物(1%，w/v)能刺激Lactobacillus acidophilus和Bifidobacterium animalis的增殖。通过对227株乳酸菌的全基因组关联分析发现，pepO、pepF、oppC和oppD基因与菌株发酵速率显著相关。

  这些研究表明，牛奶肽代谢物谱可能会影响乳酸乳球菌乳亚种菌株的生长，从而控制发酵时间。 脂肪分解是指通过脂肪酶和酯酶降解脂肪，这对发酵食品的成熟和风味产生至关重要。以前的研究未能确定在碳水化合物、蛋白质和脂肪/酯混合环境中生长的菌株首先利用的确切能量来源，但一项研究之后发现，一些基因(特别是直接参与核糖分解代谢磷酸转酮酶途径以及丙酮酸替代途径的基因的转录)在额外的碳水化合物或其他代谢物的存在下会减少，这些基因的过量表达可能会影响菌株的生长。有研究报道了L. sakei La22在含三丁酸甘油酯和橄榄油的培养基中生长相关基因的表达，发现在三丁酸甘油酯和橄榄油同时存在的情况下，各种应激反应基因的表达均发生了改变，而当该菌株在只有三丁酸甘油酯存在的情况下生长时，有更多参与脂质代谢的基因过度表达。在本研究中，三丁酸甘油酯在快速组中富集，在慢速组中几乎没有。

  因此，存在于发酵乳中的肽和三丁酸甘油酯代谢物使乳酸乳球菌乳亚种菌株暴露在不同的环境中，影响相关基因的表达，进而影响单个菌株的生长和发酵时间。在后续研究中，蛋白质组学和转录组学可用于探索不同环境下菌株的生物学功能，这有助于筛选出有工业价值的潜在发酵菌株。

  综上所述，由于各个乳酸乳球菌乳亚种的发酵能力不同，观察到明显的代谢组学差异。快速组富含各种肽类和酯类，这些代谢物含量的差异影响着发酵乳的风味、质量和益生特性，并且可能是控制发酵速率的一个主要的因素。此外，三丁酸甘油酯能调节乳酸乳球菌乳亚种的生长。本研究的结果可作为评估乳酸乳球菌乳亚种作为发酵菌株潜力的参考信息。